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神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究

【摘要】  目的]观察神经干细胞静脉移植对损伤大鼠脊髓功能的治疗作用。[方法]取孕14~16 d SD胎鼠的脑室下区组织,体外培养后鉴定细胞。制作脊髓全切模型,伤后1周将Brdu标记好的神经干细胞通过尾静脉注射移植到大鼠体内,移植后及8周行皮层体感诱发电位(CSEP)检测和BBB功能评分,并留损伤脊髓处作病理切片及免疫组化染色。[结果](1)移植后8周BBB评分损伤组、移植组都有所恢复,但都未达到正常水平,移植组恢复较好;(2)模型制作后,CSEP波均消失,细胞移植后8周移植组的波形有不同程度的恢复,但潜伏期延长;(3)移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu染色阳性细胞,表明移植的细胞在体内可到达损伤脊髓处并能存活;脊髓损伤部位NF-200及GFAP染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞。[结论]静脉移植的神经干细胞能到达损伤区代替受损的神经元及神经胶质细胞,使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。

【关键词】  脊髓损伤; 神经干细胞; 静脉移植; 功能恢复


  脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后自身的修复能力非常有限,死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究改变了这一观点。神经干细胞[1,2]是一类存在于中枢神经系统内具有多向分化能力的细胞,能分化成少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞。人们已经把神经干细胞视为治疗脊髓损伤的理想移植细胞。神经干细胞移植治疗脊髓损伤的途径可分为2种:(1)移植物直接植入脊髓损伤部位,此法可导致局部移植物的高密度存在,有利于局部神经纤维的再生;(2)移植物通过血液循环系统到达损伤部位。有关报道表明神经干细胞可以通过损伤部位的血脑—血脊髓屏障到达损伤部位从而修复损伤[3]。本实验旨在研究神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的疗效,为临床进一步治疗脊髓损伤提供科学依据奠定基础。

  1  材料与方法

  1.1  免疫组化试剂
     
  化学试剂5-溴脱氧尿核苷(Brdu)、小鼠抗Brdu单克隆抗体购于Sigma公司;小鼠抗巢蛋白(nestin)多克隆抗体购于Chemicon公司;小鼠抗胶质细胞酸性蛋白(GFAP)IgG1、小鼠抗神经元丝蛋白(NF-200)IgG1及FITC标记的羊抗IgG1购于武汉博士德公司;亲和素标记的Cy3购于KPL公司;细胞因子EGF、bFGF均购于Pepro Tech EC公司。

  1.2  胎鼠来源的NSCs的制备、培养、分化与鉴定[4]

  1.2.1  取胚龄14~16 d[2,5]SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞,以1.5×105个细胞/ml种瓶,用DMEM/F12(1:1)(Sigma)无血清培养基培养[内含bFGF20 ng/ml、EGF20 ng/ml、B2720 nl/ml(GibCOBRL)]。每3~4 d换液1次。

  1.2.2  对第2代细胞作免疫组化鉴定  取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张,4%多聚甲醛固定30 min。0.25%Triton-100破膜12 min,然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原,室温孵育30 min,吸干残液滴加1:500小鼠抗大鼠nestin IgG1(I抗),4℃孵育过夜。第2 d滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1 Ⅱ抗,室温孵育1 h,然后50%缓冲甘油封气,荧光显微镜下观察并摄像。

  1.2.3  神经干细胞分化鉴定[6]  神经球经机械吹打后接种到多聚赖氨酸包被的玻片上,培养基换为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。分化7 d后,行神经元丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化实验。荧光显微镜下观察并摄像。

  1.3  脊髓损伤模型的制备

  1.3.1  48只成年Wistar大鼠,体重(250±50)g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。动物腹腔麻醉后,背部剪毛,常规碘酒酒精消毒。沿脊柱正中切开皮肤,分离肌肉,暴露椎骨,用咬骨钳仔细咬去椎板,在T9与T11椎骨平面打开椎管,充分暴露T10节段脊髓背面及两侧,用弯头眼科镊将脊髓轻轻挑起,用眼科剪将脊髓完全剪断,将分离的肌肉缝合封闭椎管缺损,缝合皮肤,制成脊髓损伤模型。

  1.3.2  1周后有45只存活,将模型动物随机分为3组,每组15只:(1)正常组(A组):仅行切皮、打开椎管,不施行SCI;(2)损伤组(B组):脊髓全横断损伤;(3)移植组(C组):在脊髓完全横断后1周移植大鼠NSCs悬液。术后14 d内每天腹腔注射青霉素(1×104 u/100 g)。每天将动物的膀胱人工排空2次,直到动物自身排尿反射恢复。

  1.4  NSCs的静脉移植

  1.4.1  移植前的细胞准备  移植前12 h,在鉴定的第2代前体细胞中加入Brdu溶液(5 μmol/l)标记,37℃、5%CO2孵育。移植前调整细胞浓度为5×104/μl,放入冰中待移植。

  1.4.2  C组伤后1周尾静脉注射移植NSCs悬液,量为100 μl[7]。B组注射等量的生理盐水。

  1.5  BBB功能评分[8]评价大鼠下肢功能
   
  行为学检测参照Basso等提出的大鼠SCI后功能评判标准(简称BBB评分法)对各实验动物后肢的运动功能进行评分。所有观察都在上午进行,评分前应将所有动物的膀胱排空,时间为4 min,评分时采用双盲法。

  1.6  动物皮层体感诱发电位(CSEP)的测定[9]
   
  模型动物在术后1 d及9周行CSEP检查。每只动物均测双下肢。

  1.7  组织免疫组化检测
   
  试验大鼠在移植8周后过度麻醉并作4%多聚甲醛灌注。取出脊髓,4%PFA固定后作石腊切片。

  1.7.1  Brdu和nestin 双标免疫组化染色

  1.7.2  Brdu和GFAP双标免疫荧光染色检测

  1.7.3  组织行Brdu和NP双标免疫荧光染色检测

  1.8  统计学处理
   
  所有数据采用SPSS 12.0程序分析,P<0.05为差异显著。

  2  结果

  2.1  神经干细胞的培养、分化和鉴定情况

  2.1.1  细胞培养  神经干细胞在含有丝裂原的无血清培养基中进行体外培养,能保持其未分化的多潜能状态,并可进行大量增殖,换液后细胞生长迅速,分裂加快。在合适条件下体外培养1周左右,随着神经干细胞的不断扩增,形成悬浮生长的神经球(neurosphere)(图1)。神经球周边可长出绳索状纤维结构,相邻神经球之间可见有纤维联结(图2)。

  2.2.2  神经干细胞的鉴定  神经干细胞是一类未成熟细胞,选择性地表达某些抗原标志,如巢蛋白(nestin),属中间丝蛋白。本实验nestin免疫荧光结果发现单个神经干细胞的胞浆有明显的荧光着色(图3)。神经干细胞增殖形成的神经球也有明显的荧光(图4)。

  2.3  神经干细胞的分化能力鉴定
   
  神经干细胞具有多分化潜能,能够分化出神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。神经元丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)分别是神经元和星形胶质细胞特异性抗原标志。为了证实神经干细胞的多分化潜能,神经干细胞在撤掉丝裂原并加入血清分化1周,对分化细胞进行免疫组织化学鉴定。实验发现,分化的细胞中有NF和GFAP阳性的细胞(图5、6)。

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