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牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的双向调节作用

                      作者:郑元升,蒲含林,麻建军

【摘要】  目的 从牛大力(Millettia Speciosa Champ.)提取纯化多糖,流式细胞术检测多糖对刀豆蛋白A(Con A)刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖的影响,探讨牛大力多糖对免疫系统的调节作用机制,为临床用牛大力治疗多种慢性疾病提供理论和实验依据。方法 提取、纯化牛大力多糖,利用CFDA-SE染色,流式细胞术检测多糖对Con A刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖的影响。结果 终浓度为160 μg/mL、 800 μg/mL、4 mg/mL、20 mg/mL的多糖对小鼠T淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制,而终浓度为5、25、50、125 μg/mL的多糖对小鼠T淋巴细胞增殖起促进作用,剂量依赖关系不明显。结论 牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞的增殖呈双向调节作用。

【关键词】  牛大力;多糖;T淋巴细胞;CFDA-SE

  Abstract:Objective The polysaccharide was extracted and purified from Millettia Speciosa Champ. Flow cytometry was used to investigated the effects of polysaccharide on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A,the mechanism of the effects of polysaccharide on the immune system was explored and theoretical and experimental evidence for the clinical application of Millettia Speciosa Champ in treating chronic diseases were drawn.Methods  The polysaccharide was extracted and purified from Millettia Speciosa Champ,CFDA-SE staining and flow cytometry were used to detect the effects of polysaccharide on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A.Results  The polysaccharide has the function to inhibit the proliferation of lymphocyte of mouse depending on its concentration with 160 μg/mL,800 μg/mL,4 mg/mL,20 mg/mL in substrate,but promotes the proliferation of T lymphocytes of mice lymph node at the concentrations of 5,25,50,and 125 μg/mL,,but the dose-dependent effect is not significant.Conclusion The polysaccharide extracted from Millettia Speciosa Champ has the two-way effects on T lymphocyte proliferation in mice lymph node stimulated by Con A.

  Key words:Millettia Speciosa Champ.; polysaccharide; T lymphocyte; CFDA-SE

  牛大力(Millettia Speciosa  Champ.)又叫山莲藕、大力薯,豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia speciosa  Champ.)的干燥根[1],主产于广东东部。牛大力用药始载于《生草药性备要》[2],历史悠久,性味甘、平,具有补虚润肺、强筋活络的功用,临床主要用来治疗肺热咳嗽、风湿性关节炎、腰肌劳损、胃溃疡、慢性肝炎、肺结核等疾病[1]。早在20世纪70年代,牛大力作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊的原料已用于中成药的生产[3]。目前,对牛大力免疫活性的研究有过报道[4],但对其多糖药理活性尚未见报道。本文提取、分离、纯化牛大力多糖,鉴定多糖主要的理化性质,并利用CFDA-SE染色、流式细胞术研究多糖对刀豆蛋白A(Con A)引起的T淋巴细胞增殖的影响,为阐明其对免疫系统的影响及临床治疗多种疾病提供理论和实验依据,为牛大力的进一步开发利用提供科学依据。

  1  材料

  1.1  动物   雄性SPF级Bal b/c小鼠,4~5周龄,体质量(12±2) g,由中山大学动物所提供(合格证号00A005)。

  1.2  试药与仪器    牛大力购自广州天河石牌东百康源大药房,经鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia Speciosa  Champ.)的根;Vy-brantTMCFDA-SE Cell Tracer Kit(c-1288)购自美国Molecular Probes公司;Con A、RPMI-1640、胎牛血清、L-谷氨酰胺、β-二巯基乙醇均购自美国Sigma公司;FAC-SCalibur流式细胞仪,为美国Becton Dickinson公司产品;旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂。

  2  方法与结果

  2.1  牛大力多糖的理化性质测定

  2.1.1  牛大力多糖的提取和纯化  称取新鲜干燥的牛大力切片800 g,粉碎,用6倍量的水,加热到90 ℃煮1 h,过滤,再加5倍量的水,煮1 h后过滤,再重复1次,合并3次的滤液,旋转蒸发浓缩,向浓缩液中加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到80%,析出大量白色絮状沉淀,4~8 ℃放置过夜后抽滤。再用适量的水溶解,加入总体积25%的Sevage试剂(三氯甲烷∶戊醇=5∶1),振摇后形成胶状物,离心除去析出物和乳化层的蛋白,重复2次操作除尽蛋白。浓缩上清液,装入分子量范围为8 000~10 000的透析袋中于流动的蒸馏水中透析过夜,将透析袋中溶液取出,浓缩后再加入无水乙醇至乙醇的浓度达到80%,4~8 ℃放置过夜后抽滤。将沉淀依次用丙酮、甲醇洗涤脱色,50 ℃烘干即得到牛大力多糖[5]。

  2.1.2  多糖的含量测定  参照文献[6,7],采用蒽酮-硫酸法检测粗品中糖含量,与标准曲线对比,得到线性回归方程y=0.0047x-0.0003,计算得到牛大力多糖的糖含量为96.3%。如图1所示。

  图1  蒽酮硫酸法测定牛大力多糖的糖含量(略)

  Fig.1  Content of polysaccharide in Millettia Speciosa Champ. measured by sulfuric acid-anthrone

  2.2  牛大力多糖对Con A刺激引起的小鼠T淋巴细胞增殖的影响

  2.2.1  淋巴细胞悬液的制备  将Bal b/c小鼠断髓处死,无菌取小鼠颈部、腋下、腹股沟以及肠系膜的淋巴结,去掉被膜,200目筛网研磨过滤,收集细胞,用PBS离心(180×g,10 min)洗涤细胞2次,PBS重悬。

  2.2.2  淋巴细胞CFDA-SE染色  CFDA-SE用DMSO溶解成10 mmol/L的储存液,-20 ℃保存,临用前,取适量用PBS稀释成1 mmol/L的工作液,平衡至室温备用。调整淋巴细胞悬液的密度为107cells/mL,细胞悬液按10 000∶1(体积比)加入CFDA-SE工作液后,在室温条件下避光充分混匀10 min,然后用RPMI-1640完全培养液(含体积分数10%FBS)离心(180×g,10 min) 洗涤细胞2次,并调整细胞浓度为2×106cells/mL。

  2.2.3  多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的影响  将上述经CFDA-SE标记的淋巴细胞接种于96孔细胞培养板,分别设置空白对照组,Con A组,Con A+多糖溶液实验组。实验组中多糖终浓度分别5、25、50、125、160、800 μg/mL,4、20 mg/mL,定容至200 μL/孔,上述各实验组Con A的浓度均为5 μg/mL。在37 ℃,5% CO2温箱培养48 h后对CFSE荧光强度(FL1)进行检测。

  2.2.4  流式细胞仪检测、分析及数据统计  羧基荧光素乙酰乙酸 (CFDA- SE)是一种染色细胞结构蛋白的荧光染料。本文采用的CFDA-SE标记技术就是利用CFDA-SE随细胞每增殖一代,荧光强度的系列减半特征,结合流式细胞术,动态追踪分析细胞增殖的技术,计算出增殖指数(proliferation index,PI),即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比值),研究T细胞的增殖[8,9]。
      
  从FAC-SCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取数据。在前散射(FSC)和对侧散射(SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区R,分别对每个组别的这群细胞的FL1强度进行检测。每管样品检测10 000个细胞,获得的数据用CELLQuest 软件分析。统计方法用t检验,数据以均值±标准差(x±s)表示。

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