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青蒿琥酯抑制MCF7细胞的机制探讨

                    作者:赵小波 ,刘明学,吴凯南, 幸天勇

【摘要】    目的 探讨青蒿琥酯(Artesunate,ART)对乳腺癌细胞MCF7抑制作用及其机制。方法 ART处理细胞3天后,采用MTT比色法检测细胞增殖功能,观察细胞形态、结构的改变,免疫细胞化学检测bax、nm23、PCNA、VEGF、bcl2蛋白的表达情况。结果 ART对乳腺癌细胞MCF7的抑制作用呈明显浓度依赖性,可导致细胞形态、结构的改变;免疫细胞化学结果显示20μmol/L青蒿琥酯作用两种细胞72小时后,可上调bax、nm23,下调PCNA、VEGF蛋白的表达,bcl2蛋白表达无明显变化。结论 ART有抑制MCF7细胞增殖的作用,其机制可能与上调bax、nm23,下调PCNA、VEGF蛋白的表达有关。

【关键词】  青蒿琥酯 bax;nm23 PCNA;VEGF;bcl2

  Effects of Artesunate and Its Mechanism on MCF7 Cells

     1.Department of General Surgery,The  Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China;2.Department of General Surgery,The  Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical science

       Key words:Artesunate;bax;nm23;PCNA;VEGF;bcl2

  近年,中药在提高癌症患者的生存质量和延长生存期等方面对乳腺癌治疗的发展带来了新的契机。抗疟药青蒿琥酯(ART)是青蒿素衍生物,体内外实验证实对肝癌细胞有诱导凋亡的作用[1,2],对结肠癌等55种细胞株均有细胞毒作用[3]。国内尚未见ART对人乳腺癌细胞影响的相关报道。本实验采用ER阳性的乳腺癌细胞株MCF7为研究对象,探讨ART抑制乳腺癌细胞作用及其机制,为进一步研究提供理论依据。

    1材料与方法

    1.1药物、试剂及其配置

    1.1.1药物

    ART由广西桂林第二制药厂生产。60mg ART由5%碳酸氢钠1ml配成储备液,-20℃保存。实验时用1640液稀释所需浓度,碳酸氢钠的终浓度<0.09%。

    1.1.2试剂

    RPMI1640(购于美国Hyclone公司),10%小牛血清(购于杭州四季青生物工程材料有限公司),80mg/L青霉素及120mg/L链霉素(购于重庆医大附一院药房),MTT(购于Sigma公司)。

    1.2细胞培养与处理

    MCF7购于中科院上海生物研究所细胞库。用含10%小牛血清的1640培养基,在37℃、体积分数为5%的CO2孵箱中常规培养传代。细胞长至瓶底80%~90%时处于对数生长期,用0.05%胰酶—0.02% EDTA消化后,5min 800转离心,弃上清液,1640培养基制成单细胞悬液即可备用。

    1.3 MTT比色法检测细胞增殖功能

    1.3.1实验分组

    实验分为九组:空白对照组、细胞对照组、溶剂对照组(0.09% NaHCO3)、药物组(2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)。

    1.3.2步骤

    将5.0×104/ml浓度细胞加入96孔板中,200μl/孔。培养24h后,细胞贴壁,分别加入不同处理因素。每组设八个平行孔,在额定的时间取出培养板,吸去各孔培养液,换上200μl无血清1640并加入20μl的MTT(5mg/ml),轻振培养板,放回CO2孵箱中再培养4h后,10min 4000转离心,弃上清液,加DMSO 200μl/孔,振荡器上振荡5~10min,空白调零,在微量板读数仪中测出每孔中600nm处的OD值。并计算出ART对乳腺癌细胞的抑制率,重复3次。

    乳腺癌细胞存活率=抗癌药物组吸光度值/细胞对照组吸光度值×100%

    乳腺癌细胞抑制率=1-乳腺癌细胞存活率

    1.4形态学观察

    20μmol/L ART处理细胞3d后,细胞HE染色后在光学显微镜下观察。

    1.5免疫细胞化学检测

    1.5.1步骤

    细胞爬片用PBS洗两次。过氧化氢孵育10min,TritonX100/PBS穿孔,1%胰酶37℃消化30min,PBS冲洗后,滴加试剂1(正常三阳血清)封闭无关抗原,室温孵育10~15min,滴加适当一抗工作液,4℃冰箱过夜,滴加生物素二抗,室温孵育,滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素, DAB显色,复染,酸酒精褪色后封片。

    1.5.2判断标准

    参照Lessey等[4]判断标准,阳性细胞染成棕黄色,用HSCORE系数作半定量评分。计算出100个细胞中各强度的百分比,求HSCORE的值,并取其平均值。

    1.6统计学处理

    实验采用SPSS10.0软件包进行方差分析。

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