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肝细胞生长因子对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究

                       作者:都红蕾,孙奋勇,陈勍,潘秋辉

【摘要】  目的 观察肝细胞生长因子(HGF)对子宫内膜癌细胞HEC2B增殖的影响及子宫内膜癌细胞HEC2B中HGF受体Cmet的表达,了解HGF对子宫内膜癌细胞的作用及其机制。方法 体外培养人子宫内膜癌细胞HEC2B,用RTPCR的方法检测HEC2B中HGF受体Cmet有表达。对HEC2B进行24 h血清饥饿后用不同剂量的HGF作用于HEC2B。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析细胞的增殖力,用流式细胞仪检测细胞的增殖周期。结果 Cmet在HEC2B细胞中稳定表达,HGF促进细胞的增殖,并在一定的范围内有剂量依赖关系,各处理组与对照组相比,P<0.05。当HGF浓度达到60 ng· mL-1时,增殖水平较对照上调约1.9倍。结论 HGF/Cmet能够在体外促进子宫内膜癌细胞的增殖。

【关键词】  子宫内膜癌细胞;肝细胞生长因子;肝细胞生长因子受体

  Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor Cmet and understand the molecular mechanism. Methods  Endometrial cancer cell line, HEC2B was cultured in vitro. The expression level of Cmet in HEC2B was determined with RTPCR. HEC2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical evaluations were conducted using ttest. Results  Cmet was expressed in HEC2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC2B in a dosedependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion  Cmet was expressed stably in HEC2B cells. HGF/Cmet system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.

  Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor

  子宫内膜癌是女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一,近20年来在世界范围内子宫内膜癌发病率有上升趋势。肝细胞生长因子(HGF)是一个多功能生长因子。HGF的单一受体Cmet是一跨膜蛋白,由原癌基因Cmet编码。在许多恶性肿瘤中Cmet被过表达[1-6]。HGF/Cmet与子宫内膜癌的关系却鲜有报道。本研究通过观察子宫内膜癌细胞中Cmet的表达及HGF对子宫内膜癌细胞的作用,旨在为临床以HGF/Cmet为靶点治疗子宫内膜癌提供理论基础。

  1  材料与方法

  1.1  试剂与细胞株

    子宫内膜癌细胞株HEC2,购自中科院细胞库;RNase、胰蛋白酶、DMEM 培养基、Trizol、逆转录酶Superscript Ⅲ为Invitrogen公司产品;优质胎牛血清,Gibco公司;HGF购自R&D, Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix购自ABI公司。EPICS AL TRA流式细胞仪,美国Beckman Coulter公司提供。

  1.2  HEC2B细胞的体外培养与诱导

    将细胞以1×105/cm2接种于细胞培养瓶中,每瓶加入5 mL含10%(φ)FBS(胎牛血清)的DMEM;培养24 h后,换5%FBS的DMEM饥饿培养12 h,分别加入浓度为20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF进行处理,设置空白组不进行诱导,培养基中FBS的浓度改成5%;培养48  h后收集细胞。

  1.3  PCR 

  用PBS清洗细胞,用Trizol法抽提RNA,并常规检测RNA的纯度及完整性。反转录,用人的βactin基因检测反转录是否成功。PCR条件为:94 ℃ 5 min 激活聚合酶,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃45 s,共33循环,72 ℃保温10 min,4 ℃保温10 min。采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。Realtime定量PCR条件为:95 ℃ 5  min 激活聚合酶,95 ℃变性15 s,57 ℃退火5  s,72 ℃ 25 s,共45循环。采用ABI7300系统进行检测,每个循环结束检测荧光强度。融解曲线分析:每分钟读1次,检测范围为55 ℃ 到 95 ℃。荧光强度检测采用动态跟踪的方法,自动测出Ct值(每个反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数),用2△△Ct 表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,并采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。Βactin引物序列如下:上游引物  5′gctct tttcc agcct tcctt3′,下游引物 5′ tgatc cacat ctgct ggaag3′。Cmet检测引物序列:上游引物5′ttcaagtagc caaagcgatg3′,下游引物 5′gtgtttacgtcaggataag3′ 。Cmet检测引物序列:上游引物5′ttcaagtagc caaagcgatg3′,下游引物 5′gtgtttacgtcaggataag3′,产物大小300 bp。

  1.4  用MTT法检测细胞增殖能力  

  取对数生长期的细胞,用含0.25%(φ)胰酶消化,悬浮于适量培养基中,通过细胞计数将其浓度调整到4×104个细胞/mL。将此细胞悬液以100 μL/孔均匀接种到细胞培养板上,置于37 ℃,5%CO2的培养箱中,培养24 h后,换成稀释液,继续培养24 h,使细胞饥饿。分组加药,分别将含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培养液100 μL加入细胞培养孔中,每个稀释度做4个复孔,设立空白对照组。加样后置于37 ℃,5%CO2的培养箱中继续培养44 h,每孔加入20 μL MTT染色液,继续培养4 h;弃去培养液,加入抽提液150 μL/孔,置于微量振荡器张充分振匀以抽取染料,振动15 min。以570 nm为检测波长,630 nm为参考波长,用酶标仪测定各孔的吸光值(A)

  1.5  流式细胞检测

    消化并收集细胞,每检测管中(0.5~1)×106细胞,PBS清洗一遍,离心去上清,转速1 000  r/ min,5 min,沿管壁缓慢加入终浓度70%(φ)的乙醇,混匀,-20 ℃ 固定过夜,1 000 r/min 离心5 min去上清,PBS清洗一遍,加入Rnase抑制剂50 μL,加入50 μg/mL的PI染料混匀,4 ℃ 避光30 min,上机检测。

  1.6  统计学方法

    采用t检验,P<0.05 为差异有显著性。

  2  结  果

  2.1  HEC2B的培养与传代  

  HEC2B为起源于子宫内膜癌的细胞系,在10% 胎牛血清( Fetal Calf Serum, FCS),DMEM培养基,5% CO2,37℃的培养条件下,细胞生长良好,其形态见图1所示。

    将上述总RNA逆转录后,采用PCR的方法进行扩增,电泳后进行EB染色(图3),发现得到条带的大小与预计的300 bp相符合,表明在HEC2B细胞中具有Cmet基因的转录。

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