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           作者:徐滨,宋来君,刘献志,徐国本,张智峰

【关键词】  星形细胞瘤;前列腺素内过氧化物合酶;逆转绿聚合酶链反应;免疫组织化学

  Expression and clinical significance of cyclooxygenase2 in human astrocytoma

  【Abstract】 AIM: To investigate the role of cyclooxygenase (COX) in the development and progression of human astrocytomas through examining the expressions of COX1 and COX2 in human astrocytoma tissue and normal brain tissue. METHODS: Reverse transcriptasepolymerase chain reaction(RTPCR) and immunohistochemistry(SP) were applied to detect the mRNA and protein expressions of COX1 and COX2 in human astrocytoma tissue and normal brain tissue. Furthemore the relationship between COX expression levels and cancer pathological grades was analyzed. RESULTS: Using RTPCR, all 20 fresh  specimens from human astrocytomas were shown to express COX2 mRNA, while no positive expression of COX2 mRNA was found in 8 specimens of normal brain tissues; there was a significant difference between the two(P<0.0001). But COX1 mRNA was expressed constitutionally in all 20 of the fresh cancer tissues and 8 samples of normal brain tissues. The immunohistochemical result showed that COX2 protein was mainly localized at cytoplasm of malignant cells(positive rate was 72%), but was not expressed in normal brain tissues. In contrast, COX1 protein was mainly localized at brain cells in normal brain tissue(positive rate 100%), but was not expressed in human astrocytomas. In 50 paraffin embedded specimens of human astrocytomas, the intensity of COX2 expression was associated with tumor grade and stage. The level of COX2 expression was higher in grade Ⅲ, Ⅳ tumors than in grade Ⅰ, Ⅱ tumors. CONCLUSION: The expression of COX2 mRNA and protein is enhanced in human astrocytomas and is associated with malignant degree of the tumor,indicating that COX2 may play an important role in the development and progression of human astrocytomas.

  【Keywords】 astrocytoma; prostaglandinendoperoxide synthase; reverse transcriptasepolymerase chain reaction; immunohistochemistry

  【摘要】  目的: 通过检测环氧化酶1(COX1)和环氧化酶2(COX2)在人脑星形细胞瘤、正常脑组织中的表达,探讨COX在人脑星形细胞瘤发生发展中的作用. 方法: 应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和免疫组化SP法检测人脑星形细胞瘤、正常脑组织中COX1, COX2 mRNA和蛋白的表达及其与肿瘤恶性程度、病理级别的关系. 结果: RTPCR检测20例人脑星形细胞瘤组织COX2 mRNA均阳性表达,正常脑组织中未见表达,两者有显著性差异(P<0.0001);COX1 mRNA在20例肿瘤标本及正常脑组织中均有结构性表达. 50例人脑星形细胞瘤标本免疫组化显示COX2蛋白主要集中在肿瘤细胞胞浆内,阳性表达率为72%,正常脑组织未见阳性表达;而COX1蛋白主要表达在正常脑组织中,肿瘤组织中为阴性表达. COX2蛋白阳性表达强度与肿瘤病理级别有关,恶性程度较高的Ⅲ, Ⅳ级星形细胞瘤高于恶性程度较低的Ⅰ, Ⅱ级星形细胞瘤. 结论: COX2 mRNA及其蛋白在人脑星形细胞瘤组织中阳性表达且与肿瘤病理级别相关,说明COX2可能在人脑星形细胞瘤的发生发展中起重要作用.
 
  【关键词】 星形细胞瘤;前列腺素内过氧化物合酶;逆转绿聚合酶链反应;免疫组织化学

  0引言
 
  星形细胞瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,呈侵袭性生长,疗效差,复发率高,其发生发展机制目前仍不明确. 环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素合成过程中一个重要的限速酶,最新研究表明,其对于癌肿的发生可能有促进作用[1]. 哺乳动物体内COX有两种同工酶:即COX1和COX2,其中COX1属于结构基因,与机体正常的生理活动有关,而COX2属于诱导基因,主要在病理组织中表达,如炎症、肿瘤等. 已证实COX2在人多种肿瘤组织中高表达[2],而其在脑肿瘤生长和病理进程中的作用,相关报道颇少. 本研究主要在基因和蛋白水平上检测人脑星形细胞瘤组织和正常脑组织中COX1和COX2的表达情况,并将表达情况与星形细胞瘤病理级别作相关性分析.

  1材料与方法

  1.1材料实验组50例人脑星形细胞瘤标本均取自于200203/200306华中科技大学同济医学院附属协和医院和同济医院神经外科首次手术切除,并经两所医院病理科医生证实为原发性星形细胞瘤组织,其中男30例,女20例,年龄26~73(平均47.29)岁. 另取正常对照10例均为上述医院脑外伤手术中内减压或暴露而切除的经病理学证实为正常的额颞极脑组织. 所有标本经40 g/L甲醛固定,石蜡包埋;同时取得其中20例病例的新鲜肿瘤组织和8例正常脑组织,液氮冷冻后,-80℃贮藏. 所有手术标本经HE染色后均按WHO1993年标准进行分型分级:低度恶性组 18例(WHO Ⅰ, Ⅱ级),高度恶性组32例(WHO  Ⅲ,Ⅳ级),毛细胞性星形细胞瘤在遗传学和临床上均明显有别于其他类型的星形细胞瘤,故在本研究中未包括此类病例.
 
  1.2主要试剂RNA提取试剂盒,美国Gibco公司产品MMLV逆转录酶,dNTP, Rnasin, Oligo(dT),美国Promega公司产品. TaqDNA聚合酶、PCR Marker,华美公司产品. 人COX1引物上游序列: 5′ CCATTCAGTTCCCACCATCT3′, 下游序列: 5′TCACTGCTGTTGGGTCTCTG 3′,预计扩增产物:601 bp;COX2引物上游序列: 5′CAGCACTTCACGCATCAG TT3′,下游序列: 5′TCT GGT CAA TGG AAG CCT GT 3′,预计扩增产物:756 bp;人内参对照物β肌动蛋白引物上游序列: 5′CACCCCCACTGAAAAAGATGA3′,下游序列:5′CATCTTCAAACCTCCATGACG3′, 预计扩增产物:326 bp. 所有引物均由上海生物工程公司合成. 兔抗人COX1, COX2多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的二抗均为美国Santa Cruz产品. 碱性磷酸酶显色试剂盒为武汉中健公司产品. SP免疫组化检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司生产.
 
  1.3方法

  1.3.1逆转录多聚酶链反应(RTPCR)测定新鲜冻存组织COX1, COX2 mRNA表达① 组织总RNA提取: 以Trizol一步法进行,按试剂说明书操作. ② 制备cDNA: 每份样品取2 μg总RNA, Oligo(dT) 1 μL, 加4 μL DEPC水于EP管中, 70℃变性5 min,然后冰上放置5 min. 依次加入1 μL dNTP, 20 u RNasin, 200 u MMLV, 5×MMLV buffer 5μL, MgCL2 2.5 μL,总体积为25 μL. 反应条件: 42℃, 1 min; 90℃, 5 min. 4℃保存. ③ PCR扩增: PCR的反应体系为: 10×PCR缓冲液2.5 μL, dNTPs  2.5 μL, COX1或COX2探针1 μL, βactin探针1 μL, cDNA 2 μL,Taq DNA聚合酶1.5 μL, MgCl2 1.5 μL,加无菌水至25 μL,用20 μL矿物油覆盖. COX1的扩增条件为: 94℃变性30 s, 58℃退火40 s, 72℃延伸30 s, 30个 循环. COX2扩增条件为:94℃预变性1 min, 59℃变性1 min, 56℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环.
 
  1.3.2免疫组化染色采用链霉素生物素过氧化酶(SP)染色法,主要步骤:  脱蜡与水化;抗原修复; 抑制内源性过氧化物酶;加一抗;加二抗;滴加链霉素生物素过氧化物酶复合物孵育;显色反应;复染;脱水、透明、封片;显微镜观察. 每批染色均置空白及阳性对照,用PBS取代一抗染色做空白对照,用已知结肠癌阳性染色片作为阳性对照.
 
  1.4免疫组化结果判定按Denkert[3]法作为本实验的判定标准,以细胞浆内或核膜上呈棕黄色者为阳性. 每张切片记数10个高倍视野下(×400)肿瘤细胞的阳性细胞数与肿瘤细胞总数(总数不少于500个)的比例,取其平均值作为标本的阳性率,以阳性细胞>10%为阳性表达;≤10%为阴性表达. 阳性程度分级:(-)无阳性细胞,(+)为阳性细胞占总数≤30%,()为阳性细胞占总数30%~50%. ()为阳性细胞占总数50%以上.
 
  统计学处理: 所有数据应用SPSS10.0软件包进行处理,率的比较采用χ2检验及Fisher精确检验法,α=0.05为显著性检验水准.

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