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TBI和环磷酰胺选择性去除同种异基因反应 供者淋巴细胞的研究

                作者:陈宝安,董伟民, 丁家华,孙雪梅,邓晓静, 张琰,毕延智

                       赵刚, 高冲,孙耘玉,王骏,程坚,Schmitt M2 ,Schmitt A2

【摘要】    本研究用全身照射(TBI)和环磷酰胺(CY)选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞,为预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生探索新的手段。以(BALB/c×C57BL/6)F1雌性小鼠(H2d/b)为受鼠,于第0天接受亚致死量的60Coγ射线全身照射,总剂量为4 Gy,第1天接种P388D1白血病细胞,第2天输注由C57BL/6雄性小鼠(H2b)为供鼠提供的MHC不匹配的供者脾淋巴细胞,在造血干细胞移植前诱导移植物抗白血病效应(GVL)。第6天腹腔注射环磷酰胺(CY)200 mg/kg或再次TBI 9 Gy,选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞,第7天输注(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠(H2d/b)提供的骨髓造血干细胞。结果显示:以CY和TBI选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和GVHD的发生,生存期超过了210天,于移植后第21天出现完全供者嵌合,然后嵌合率下降,第90天表现为混合嵌合体(MC)。对照组的小鼠出现了白血病和GVHD,出血、感染明显,生存期短,为20-36天(P<0.01)。结论:同基因骨髓移植前输注不相匹配的供者脾细胞诱导GVL效应,然后再通过TBI和CY选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生是可能的。

【关键词】  同种异基因造血干细胞移植;同种异基因反应供者淋巴细胞;移植物抗白血病效应;移植物抗宿主病;全身照射;环磷酰胺

  Selective Elimination of Alloreactive Donor Lymphocytes by Using TBI and Cyclophosphamide

       Abstract    This study was aimed to investigate a new method of avoiding graftvshost disease (GVHD)  through selective elimination of alloreactive donor lymphocytes by using total body irradiation (TBI) and cyclophosphamide (Cy). Female (BALB/c×C57BL/6)F1 mice (H2d/b) as recipients received 60Co γray sublethal TBI  of 4 Gy on day 0 followed by being inoculated with P388D1 leukemia cell line on day 1,injection of allogeneic splenocytes from  C57BL/6 male mice(H2b) was carried out for induction of graftvsleukemia (GVL) effect prior to stem cell transplantation (SCT) , intraperitoneally injection of cyclophosphamide (Cy) (200 mg/kg) and TBI (9 Gy) was given on day 6. One day later, treated mice were rescued with  bone marrow hematopoietic stem cells from  (BALB/c×C57BL/6)F1 male mice(H2d/b). The results showed that recipients had no occurrence of leukemia and GVHD through  selective elimination of alloreactive donor lymphocytes by Cy and TBI, survived more than 210 days,the completedonor chimerism occured on day 21 after transplantation. The ratio of chimerism descended subsequently, but still displayed mixedchimerism at 90 days. Control mice died of  GVHD, leukemia or other deathrelatedtransplantation within 20 to 36 days(P<0.01).It is concluded that to induce GVL effects by MHC mismatched splenocytes given before syngeneic bone marrow transplantation followed by selective elimination of alloreactive donor lymphocytes through TBI and Cy, graftvshost disease was thus  avoided.

    Key words    allogeneic  hematopoietic stem cell transplantation;alloreactive donor lymphocyte;graftversusleukemia;graftversushost disease; total body irradiation; cyclophosphamide

        异基因外周血造血干细胞移植(alloHSCT)是治疗恶性血液病和某些实体瘤的重要手段,移植物抗宿主病(GVHD)是异基因外周血造血干细胞移植主要的并发症和死亡原因。目前预防GVHD的措施主要是在移植前后应用细胞毒药物和免疫抑制剂,虽可明显降低GVHD的发生,但也减弱了移植物抗白血病效应(GVL)或移植物抗肿瘤效应(GVT),从而导致白血病或肿瘤的复发。本研究探讨造血干细胞移植前诱导移植物抗白血病效应。我们在造血干细胞移植前输注不相匹配的供者淋巴细胞,然后再用全身照射(TBI)和环磷酰胺(CY)选择性地去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防移植物抗宿主病的发生。

     白血病细胞株

    小鼠急性淋巴细胞白血病细胞系P388D1(P388)购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库,然后将其置于RPMI  1640(Gibco公司产品)培养液(含15%小牛血清,碳酸氢钠1-2 g/L,HEPES 2.38 g/L,Glu 300 mg/L,青霉素、链霉素各200 U/L)进行传代培养,每3-4天传代1次。培养条件:5% CO2、饱和湿度、37℃。

    动物

    受鼠为清洁级(BALB/c×C57BL/6)F1雌性小鼠(H2d/b),10-12周龄,体重19.5±1.5 g;供鼠为清洁级雄性C57BL/6小鼠(H2b,B6)和(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠(H2d/b),由扬州大学畜牧兽医学院提供,均饲养于东南大学医学院SPF级动物房内,饲料及垫料均经辐照消毒,饮用高压消毒无菌水。

    试剂及器材

    环磷酰胺(CY,200毫克/支)为上海华联制药有限公司产品,TRIzoL RNA抽提试剂盒为Invitrogen公司产品,60Co放疗机(中国核动力研究设计院研制的GWGT80型60Co远距离治疗机),由南京市第二人民医院提供帮助。

    移植细胞的准备

    C57BL/6雄性(H2b)供鼠,颈椎脱位法处死, 75 %的乙醇中浸泡5分钟,无菌条件下取出脾脏,置于200 目金属过滤网上,用研磨棒轻轻按压,用RPMI 1640 培养液冲洗,细胞悬液洗涤3 次,计数,调整浓度为5×107/ml 。(BALB/c×C57BL/6)F1雄性供鼠(H2d/b)同样在无菌条件下剥离股骨及胫骨,剪去两端,用RPMI  1640 培养液冲出骨髓,制成细胞悬液,洗涤3 次,计数,调整细胞浓度为1×108/ml;

    白血病细胞接种、脾淋巴细胞输注和骨髓移植

    (BALB/c×C57BL/6)F1雌性受鼠(H2d/b),移植前5 天 开始饮用含红霉素250 mg/L 、庆大霉素320  mg/L 的冷却开水。第0 天 置于清洁级包装的塑料盒内接受60Co  γ射线4.0 Gy全身照射,照射距离80 cm , 照射时均为立式体位,剂量率500 cGy/min。第1天接种P388D1白血病细胞株0.5 ml,含细胞数0.5×107,第2天输注由C57BL/6雄性小鼠(H2b)为供鼠提供的MHC不相匹配的供者脾淋巴细胞0.3 ml,细胞数1.5×107,第6天腹腔注射环磷酰胺(CY)200 mg/kg或再次TBI 9 Gy,照射方法同前,第7天输注由(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠(H2d/b)提供的骨髓细胞0.3 ml,含细胞数3×107。

    实验分组

    将(BALB/c×C57BL/6)F1雌性受鼠(H2d/b)随机分为6组。A组:TBI+输注白血病细胞株P388D1(n=8);B 组:TBI+输注白血病细胞株P388D1+脾淋巴细胞输注(n=8);C组:TBI+输注白血病细胞株P388D1+脾淋巴细胞输注+TBI(n=8);D组:TBI+输注白血病细胞株P388D1+脾淋巴细胞输注+CY(n=8);E组:TBI+输注白血病细胞株P388D1+脾淋巴细胞输注+TBI+骨髓细胞输注(n=8);F组:TBI+输注白血病细胞株P388D1+脾淋巴细胞输注+CY+骨髓细胞输注(n=8)。

    主要的观察项目

    一般状况  移植后每日观察受鼠体形、体位、毛发、进食及精神情况,有无弓背、翘毛、腹泻等表现,定期称量体重,记录每只小鼠的存活时间并计算存活率,存活时间超过60天者为长期存活。

    外周血白细胞计数及形态学检查  取尾血,白细胞稀释液稀释,常规计数白细胞,镜下观察白细胞形态并分类。

    病理学检查  解剖死亡受鼠,大体观察脏器的形态,然后取肝、脾、肺、小肠和足底皮肤等组织标本,用10 %的甲醛固定,常规包埋、切片、HE 染色后镜下观察形态变化,判断白血病和GVHD情况。

    异基因嵌合体  用RTPCR测定,于移植后第21、60、90天分别经内眦静脉取各组小鼠外周血250 μl,EDTA抗凝后,Ficoll分离淋巴细胞后再提取RNA,然后经逆转录成cDNA。再行PCR扩增: SRY基因引物用DNAStar软件设计,由上海生工生物工程公司合成,上游引物序列为5′ATTTATGGT GTGGTCCCGTGGTGA3′,下游引物序列为5′ATG TGATGGCATGTGGGTTCCTGT3′,扩增产物为305 bp;以GAPDH为内参照,上游序列为5'GGTGTG AACGGATTTGGCCGTATT3',下游序列为5'GAG CCCTTCCACAATGCCAAAGTT3',扩增产物为504 bp。PCR反应体系:10×PCR缓冲液5 μl,25 mmol/L MgCl2  5 μl,dNTPs 1 μl,25 μmol/L上游及下游引物各0.5 μl,DNA模板2 μl,TaqDNA聚合酶0.5 U(大连宝生物公司提供),用灭菌双蒸水补足至50 μl。扩增条件:94℃预变性2分钟,94℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸1分钟,循环35次,72℃再延伸7分钟。扩增产物在含0.5 mmol/L溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中以4-5 V/cm电压降电泳30-45分钟,于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像。用Total  lab V2.01凝胶图像分析软件进行定量分析。

    死亡原因判别标准

    白血病死亡  接种白血病细胞后肝脾明显肿大、腹水、外周血白细胞升高,涂片见大量细胞,病理学见肝、脾、肺等组织中大量P388D1细胞浸润。

    GVHD  在移植后2 周左右出现弓背、翘毛、腹泻、体重减轻、精神萎靡等表现,参照文献[1]判别有无GVHD 病理学改变。

    出血、感染死亡  在本实验中除白血病死亡及GVHD死亡外,在移植前后出现的造血抑制所致感染、出血等原因引起的死亡。

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